menu close Teknologiens Mediehus
person Konto arrow_drop_down
Det er en bidende kold morgen i marts, men jorden er heldigvis blød. Måske også lidt rigelig blød, for det giver lidt bøvl at få jordprøven over i den medbragte pose uden at få for meget græs med.
Ingeniøren er taget til Aalborg for at følge en arbejdsdag for nogle af hovedpersonerne bag det såkaldte Microflora Danica-projekt. Projektets mål er gennem gensekventering at fastslå, hvilke stammer af bakterier vi har i det danske land og vand.
»Vi arbejder som regel i en radius på ca. 5 meter på et prøvested, og så prøver vi at undgå at få græs, orme og edderkopper med. Deres DNA er vi ikke så interesserede i,« fortæller Vibeke Rudkjøbing Jørgensen, som er postdoc ved Institut for Kemi og Biovidenskab ved Aalborg Universitet og koordinator på projektet.
Vi hiver jord op tre steder fra fodboldbanen uden for instituttet og tager billeder af omgivelserne. Prøverne bliver blandet i en pose, hvorefter det bliver hældt over i en plastikbøtte og forsynet med en stregkode, der sender info videre til Microflora Danica-appen. Prøve 9.714 er i hus og lagt ind i databasen.
»Vi regner med at få de sidste af i alt 10.000 prøver ind før sommer. Vi DNA-sekventerer prøverne løbende, så vi kan også snart begynde at kigge på data,« fortæller Mads Albertsen, som er professor på samme institut og leder af projektet sammen med professor Per H. Nielsen.
»Vi vil gerne forstå, hvordan mikroorganismerne påvirker vores samfund. Det ved vi, at de gør, men det er en kæmpe black box, som vi hidtil har ignoreret lidt, da det har været et teknisk udfordrende område at belyse. Men med nyudviklede metoder kan vi nu starte denne opdagelsesrejse,« siger han.
Mads Albertsen stod også i spidsen for de omfattende analyser af RNA fra positive covid-19-prøver i begyndelsen af pandemien. Analyser, som regeringen kunne bruge i planlægningen af restriktioner.
»Om vi taler bakterier fra et vandløb, virus fra en halspodning eller en blodprøve fra en patient, er fremgangsmåden den samme, når først vi har oprenset arvematerialet,« fortæller Mads Albertsen, som siden har overdraget covid-19-arbejdet til Statens Serum Institut. Sammen med Vibeke Rudkjøbing Jørgensen og syv andre kolleger er fokus derfor nu tilbage på bakteriekortlægningen, som begyndte i 2019.
Vi tager bøtten med jord med op i grovlaboratoriet på fjerde etage for at få jordprøven renset.
Der er dog ikke brug for en så stor portion jord, så vi starter med at pipettere 100 mg over i et mindre rør, som indeholder små kugler af keramisk materiale og silicaglas.
Kuglerne er af forskellig størrelse, og når man ryster prøven, slås jordklumperne i stykker, og bakteriernes cellevæg bliver ødelagt, så DNA’et kan komme ud.
I første omgang bliver prøven dog lagt på frost til senere brug, mens Vibeke Rudkjøbing Jørgensen forklarer, hvad der skal foregå, når bakken med 96 prøver er fyldt op.
Da vil prøverne blive tøet op og tilsat en væske, som stabiliserer DNA. Som regel bruges tredjepartsleverandørers væsker, så selv om forskerne ved, hvilket job væskerne udfører, så er selve indholdet oftest hemmeligt. Røret får herefter en ordentlig rystetur i ‘bead-beateren’, hvor kuglerne udfører deres del af arbejdet.
»Så får man en væske, der består af en god blanding af jord, DNA, salte og mineraler og alt muligt. Men vi er jo kun interesseret i DNA’et,« understreger Vibeke Rudkjøbing Jørgensen.
Derfor bliver prøven centrifugeret, så kugler og jord lægger sig i bunden, mens DNA, salte og andre, mindre molekyler forbliver opløst. En pipettespids bliver stukket ned i væsken for at suge den op og overføre den til en nye plade med 96 brønde.
»Det er lidt som at afskumme en gryde, og man skal være forsigtig,« fortæller Vibeke Rudkjøbing Jørgensen.
Resten af oprensningen sker ved hjælp af Qiacube-robotten, hvor en saltrig væske gør, at DNA kan binde sig til en filtermembran. Nu kan de resterende urenheder vaskes væk, så der kun er den rene DNA tilbage, som frigives ved at skylle membranen med f.eks. rent vand.
Endelig skal prøven nu enten igennem et PCR-forløb (Polymerase Chain Reaction) for at blive sekventeret på de store Illuminamaskiner – eller den kan blive håndsekventeret ved hjælp af den forholdsvis nye teknologi, Nanopore.
Se nedenfor, hvordan det foregår. Søren Heidelbach, specialestuderende på Institut for Kemi og Biovidenskab ved Aalborg Universitet samt Mads Albertsen, professor samme sted, stod for undervisningen.
Fordele: Mobil og hurtig sekventering af meget lange DNA-strenge
Ulemper: Mest egnet til få prøver, højere fejlrate end NGS (metode B).
Ved nanoporesekventering føres DNA gennem bittesmå porer. Da nukleotiderne i DNA’et har forskellige størrelser, kan man måle, hvilket nukleotid der kommer gennem poren ved at måle ændringen i spændingen over poren.
DNA’et blandes med nukleasefrit vand, og et mikrogram bliver målt af i et prøverør. En såkaldt Qubitmaskine kan bestemme koncentrationen ved, at fluorescerende farver binder til DNA’et. Herefter er det muligt at fortynde sig frem til den ønskede mængde.
Prøven tilføres et enzym samt ‘løse’ nukleotider, som forlænger evt. knækkede DNA-strenge ved at binde sig til den komplementære streng. Det foregår på PCR-maskinen, hvor prøven først rammer 20 grader i fem minutter og herpå 65 grader i fem minutter.
Prøven renses ved hjælp af små paramagnetiske kugler, som DNA’et binder sig til ved hjælp af specifikke salte. Prøven bliver sat på en magnetisk plade, så DNA’et søger derover. Nu kan man suge alt overflødigt væk med en pipette.
Herefter skyller man kuglerne med ethanol, fjerner blandingen fra magneten og løsner DNA’et fra kuglerne med vand. Røret sættes igen på magneten, og vandet med DNA kan nu suges op. Rensningen kan enten ske i hånden, som vi gjorde, da Ingeniøren var på besøg, eller på f.eks. en Opentronrobot, som både pipetterer og tilfører væsker.
Nye væsker sætter en adapter med et naturligt motorprotein på DNA’et. Det hjælper med at styre, hvor hurtigt DNA’et kravler ned gennem porerne i flowcellen. Det hele bliver renset igen med et nyt hold kugler.
Nu hældes loading beads på, som binder svagt til DNA’et og trækker det ned til membranen på flowcellen, som vi har gjort parat ved at skylle opbevaringsvæsken ud med en running buffer, som bl.a. indeholder det ATP-brændstof, som skal give energi til motorproteinet.
Kilde: Søren Heidelbach, specialestuderende på Institut for Kemi og Biovidenskab ved Aalborg Universitet.
Fordele: Kan håndtere mange prøver ad gangen og kræver kun små mængder DNA.
Ulemper: Større investering, kan kun håndtere mindre bidder DNA på op til 150 basepar, og processen tager 48 timer.
Med PCR- og Illuminasekventering er princippet at lave mange kopier af små bidder DNA, som i stort nok antal kan aflæses ved hjælp af fluorescens og kameraer. Metoden er velegnet til de helt store batches af prøver, f.eks. blodprøver eller virusprøver, hvor man leder efter bestemte varianter.
Bakkerne med DNA sættes i PCR-maskinen, hvor sekvenserne bliver klippet op i mindre bidder ved hjælp af et enzym.
Sekvensbidderne får desuden tilført adaptorer (små ens stykker DNA), som bruges for at markere læseretningen af hver streng, når de mange stykker DNA skal kopieres og mangfoldiggøres.
Maskinen opvarmer prøven til 55 grader i 15 minutter, så enzymerne kan arbejde.
Prøven renses - ligesom ved Nanopore-metoden ved hjælp af små paramagnetiske kugler, som DNA’et binder sig til ved hjælp af specifikke salte. Prøven bliver sat på en magnetisk plade, så DNA’et søger derover. Nu kan man suge alt overflødigt væk med en pipette.
Herefter skyller man kuglerne med ethanol, fjerner blandingen fra magneten og løsner DNA’et fra kuglerne med vand. Røret sættes igen på magneten, og vandet med DNA kan nu suges op. Rensningen kan enten ske i hånden, som vi gjorde, da Ingeniøren var på besøg, eller på f.eks. en Opentronrobot, som både pipetterer og tilfører væsker.
Flere enzymer og reagenser bliver tilsat, hvorefter PCR-maskinen opvarmer prøven til 98 grader. Her denaturerer hydrogenbindingerne mellem de to DNA-strenge, så de skilles.
Nu genopbygges de enkelte strenge til to ved brug af enzymet polymerase. Først sænkes temperaturen til 62 grader, hvorved små stykker tilsat DNA (primere) binder komplementært til de tidligere påførte adaptorer.
Temperaturen hæves til 68 grader, hvor polymerasen er aktiv, og nu forlænges primerne med de ‘løse’ nukleotider, så DNA-strengene bygges op igen. Cyklen gentages 12 gange, så man får masser af DNA.
Den ene streng vaskes væk, og maskinen bygger den nu op igen med fluorescerende nukleotider, én ad gangen. A, T, C og G har fået påsat hver sin farve, og fordi de helt ens strenge bliver aflæst synkront, kan man få et kraftigere lyssignal, når de bliver belyst med en laser.
Et kamera tager billeder af pladen for hvert glimt, så det ud fra farveglimt og lokation kan bestemmes, hvilken nukleotid der hører til hver bid. Disse data kan nu indgå i de videre analyser.
Kilde: Mads Albertsen, professor på Institut for Kemi og Biovidenskab ved Aalborg Universitet.
