Faglig talt: Syntetisk blodforsyning til 3D-vævsmodeller kan styrke biologisk forskning

Det 3D-printede dyrkningssystem med netværk af kunstige blodkar er på størrelse med en Lego-klods. Illustration: Niels B. Larsen og Milan F. Wesseler

Vævsmodeller er dyrkede væv af menneskeceller, som efterligner funktionerne af organets væv i kroppen. De er af stor værdi ved afprøvning af ny medicin, undersøgelse af mulige miljøgifte, og til etablering af sygdomsmodeller.

Gode vævsmodeller gør det også muligt at begrænse mængden af forsøgsdyr og kan være mere fysiologisk relevante.

De mange biologiske anvendelser giver behov for at kunne fremstille store antal helt ens vævsmodeller med lave omkostninger.

Der er brug for et syntetisk alternativ til naturlige blodkar, hvilket åbenlyst er en stor ingeniørmæssig udfordring.

Hidtil har det kun været muligt at dyrke cellerne i et enkelt lag, kaldet en 2D model, som åbenlyst er en dårlig efterligning af organernes 3D organisering.

Der er derfor stor efterspørgsel efter metoder til at kunne dyrke ægte 3D vævsmodeller.

Dyrkning af 3D væv er udfordret af at langt de fleste celler i kroppen kræver konstant forsyning med ilt og næringsstoffer for at fungere. Diffusion af ilt over større afstande end 100 µm er for langsom til at forsyne tætsiddende celler.

For store celleklynger til naturlig forsyning

Celleklynger med et tværsnit større end 200-300 µm vil derfor mangle ilt i midten. Evolutionen har løst det ved at udstyre hver af os med over 100.000 km blodkar, som transporterer iltholdigt blod ud i alle afkroge af vores væv.

Langt hovedparten af blodkarrene er under 10 µm i diameter og er placeret med mindre end 100 µm afstand.

Blodkarrene skal også være organiseret i et vaskulært netværk, som tillader tilførsel af iltrigt blod ét sted og opsamling af iltfattigt blod ét andet sted, som det sker ved hjertet.

Flere forskergrupper har forsøgt at efterligne naturen direkte ved at tilføje blodkarsceller under dyrkningen.

Desværre danner blodkarscellerne ikke et brugbart vaskulært netværk i laboratoriet. Selv hvis de gjorde, ville vævscellerne også nå at dø, inden der blev etableret forsyning med ilt og næringsstoffer gennem et nydannet netværk.

Der er derfor brug for et syntetisk alternativ til naturlige blodkar, hvilket åbenlyst er en stor ingeniørmæssig udfordring.

Dyrkning af større 3D vævskulturer

Vi har i en række år arbejdet med at få den nødvendige detaljegrad ved brug af en lys-styret 3D print-metode kaldet stereolitografi. Stereolitografi virker ved lokalt at belyse en væske der kan polymerisere til et fast materiale ved belysning.

Processen gentages med mønstret lys i mange lag, hvilket danner det ønskede 3D objekt.

I et tidligere ph.d.-projekt viste vi, at vores hjemmebyggede printer muliggør en detaljegrad ned til 10 mikrometer i et vandfyldt polymermateriale, der tillader diffusion af ilt og næringsstoffer.

Vi kunne også fremstille simple netværk af kanaler med en diameter på ca. 100 µm, der kan gennemstrømmes med væske i ugevis og forsyne små 3D-vævskulturer rundt om kanalerne.

Milan F. Wesseler har i sit netop afsluttede ph.d.-projekt videreudviklet teknologien til dyrkning af større 3D vævskulturer med specielt fokus på levervæv. Menneskets lever har et utal af funktioner, inklusive processer til kemisk omdannelse (metabolisme) af fødevarer, medicin, og giftstoffer i blodet.

Under metabolismen kan levercellerne selv blive beskadiget eller dø, og leverskader er et udbredt og stigende globalt problem. Overdosering af paracetamol (Panodil/Pinex/Pamol) er et klassisk, ofte dødeligt, eksempel.

Der er derfor stor interesse hos lægemiddelindustrien, miljømyndigheder og inden for basal medicinsk forskning for adgang til stabile levermodeller over uger til måneder til at modellere både akutte og kroniske skadevirkninger.

Leveren består af en million stort set ens metaboliske enheder af en størrelse på ca. 1 mm³. Den enkelte enhed er yderligere inddelt i tre zoner med faldende mængde opløst ilt i blodet, kaldet en iltgradient.

Hver zone udfører en undergruppe af de kemiske omdannelser af stoffer i blodet, og den samlede omdannelse sker kun, hvis stofferne passerer enhedens tre zoner i den rigtige rækkefølge.

Genskaber naturlige ilttryk

Det har derfor været en vigtig ledetråd i ph.d.-projektet at kunne genskabe de naturlige lokale ilttryk, inklusive den naturlige iltgradient. De naturlige iltforhold skal bevares i hele den ønskede dyrkningstid på uger til måneder.

Det har derfor også været nødvendigt at udvikle en metode til berøringsfri kvantitativ måling af det lokale ilttryk i et 3D væv, parallelt med udvikling af selve dyrkningssystemet.

I ph.d.-projektet har Milan designet og 3D printet dyrkningssystemer, der kan forsyne et tæt pakket vævsvolumen på over 20 mm³ med ilt og næringsstoffer (Figur 1). Til sammenligning er det kun muligt at dyrke celleklynger i volumener af 0.01-0.1 mm³ ved traditionelle metoder.

Figur 1. Foto af det 3D printede dyrkningssystem med netværk af kunstige blodkar som vist nederst i CAD tegningen (mål i millimeter; vist i delvist tværsnit) for dyrkningssystemet. Væsketilførsel og fraløb sker gennem de indsatte metalrør forbundet med slanger til en peristaltisk pumpe. Illustration: Niels B. Larsen og Milan F. Wesseler

Forsyningen sker gennem et stort antal parallelle kanaler adskilt med ned til 100 µm, svarende til typiske afstande i mange af kroppens væv.

3D printning af et dyrkningssystem med plads til tre væv tager halvanden time i en fuldautomatisk proces, hvilket er tilstrækkeligt hurtigt til at gøre metoden relevant for mange af de påtænkte anvendelser.

Milan har demonstreret at systemet kan understøtte dyrkning af tætpakkede 3D væv af leverceller fra donorer i mere end 2 uger og af 3D væv fra stemcelle-afledte leverceller i op til 3 måneder.

Dyrkede leverceller bevarer funktion

Ved brug af den udviklede metode til optisk måling af ilttryk har han dokumenteret at der både er det naturlige niveau af opløst ilt og den naturligt forekommende iltgradient under dyrkningen.

Systemet kan understøtte dyrkning af tætpakkede 3D væv af leverceller fra donorer i mere end 2 uger og af 3D væv fra stemcelle-afledte leverceller i op til 3 måneder.

Foreløbige resultater tyder på at den gode efterligning af det naturlige miljø får de dyrkede levermodeller til at bevare deres funktion langt bedre over tid, og at modellerne ved kronisk eksponering til paracetamol som test-giftstof udviser zone-afhængig celledød, præcis som det ses i leveren.

De udviklede 3D printede dyrkningssystemer giver ikke blot mulighed for at forsyne vævsmodeller med tilstrækkelig ilt, men også at forsyne dem med det fysiologisk relevante niveau af ilt.

Som eksempel er det naturlige iltniveau i hjernen ca. 5 procent og ikke 21 procent som i atmosfærisk luft, og hjernevæv dyrket ved 5 procent ilt har væsentlig mindre celledød og stress-markører end ved 21 procent ilt. Vi ser derfor store muligheder for teknologien ikke blot for lever, men også for vævsmodeller af andre organer.